Какви методи могат да се използват за изследване на взаимодействията протеин-протеин?

Могат да се използват няколко метода за изследване на взаимодействията протеин-протеин. Ето някои често използвани техники:

1. Ко-имунопреципитация (Co-IP) :Co-IP е широко използвана техника за изследване на взаимодействията протеин-протеин. Това включва имунопреципитация на един протеин (протеин на примамка) от клетъчен лизат с помощта на антитяло, специфично за протеина на примамката. След това имунопреципитираният протеинов комплекс се анализира, за да се идентифицират други протеини (протеини на плячка), които взаимодействат с протеина на примамката. Co-IP може да бъде последван от различни методи за анализ надолу по веригата, като Western blotting, масспектрометрия или имунофлуоресцентно оцветяване.

2. Изтеглящи анализи :Изтеглящите анализи се основават на принципа на афинитетната хроматография. Протеинът на стръвта е имобилизиран върху твърда подложка (като магнитни перли или агарозна смола) чрез ковалентно свързване или сливане с етикет (напр. GST или His-tag). След това клетъчният лизат или пречистената протеинова смес се инкубират с имобилизирания протеин на примамката. След промиване за отстраняване на несвързани протеини, взаимодействащите протеини (протеини на плячка) се елуират и анализират.

3. Флуоресцентен резонансен енергиен трансфер (FRET) :FRET е техника, която измерва трансфера на енергия между два близко разположени флуорофора (донор и акцептор). Когато донорните и акцепторните флуорофори са в непосредствена близост (обикновено в рамките на 10-100 Å), възбуждането на донорния флуорофор води до излъчване на светлина от акцепторния флуорофор. Този енергиен трансфер може да бъде количествено определен и използван за наблюдение на взаимодействията протеин-протеин. FRET може да се приложи по различни начини, включително маркиране на протеини със специфични флуорофори или използване на генетично кодирани флуоресцентни протеини (напр. GFP и RFP).

4. Анализ на биомолекулярните взаимодействия (BIA) :BIA, известен също като повърхностен плазмонен резонанс (SPR), е техника без етикети, която измерва промените в индекса на пречупване на границата на предметно стъкло и течаща течност. Единият от взаимодействащите протеини е имобилизиран върху стъклената повърхност, а другият протеин се прекарва по повърхността. Взаимодействието между протеините води до промени в индекса на пречупване, които могат да бъдат открити и количествено определени. BIA може да предостави информация за афинитета на свързване и кинетиката на взаимодействията протеин-протеин.

5. Изотермична титруваща калориметрия (ITC) :ITC е техника, която измерва топлинната промяна, свързана с взаимодействието между две молекули. Когато протеините взаимодействат, топлината се освобождава (екзотермично) или се абсорбира (ендотермично). ITC може да определи количествено афинитета на свързване (Kd) и термодинамичните параметри, като промяна на енталпията (ΔH) и промяна на ентропията (ΔS), на взаимодействията протеин-протеин.

6. Масиви за взаимодействие на протеин :Решетките за взаимодействие на протеини включват високопроизводителен скрининг на взаимодействия протеин-протеин във формат на микрочип. Хиляди различни протеини или пептиди са имобилизирани върху твърда повърхност и свързването на специфичен протеин от интерес се открива с помощта на белязани антитела или други методи за откриване. Тази техника позволява бърз и широкомащабен анализ на взаимодействията протеин-протеин.

7. Дрождев двухибриден (Y2H) анализ :Y2H анализът е генетичен метод, използван за идентифициране на протеин-протеинови взаимодействия в клетките на дрождите. Това включва сливане на кодиращите последователности на два протеина към два различни домена на транскрипционен фактор. Ако двата протеина взаимодействат, транскрипционният фактор се възстановява, което води до експресия на репортерен ген. Положителните взаимодействия се идентифицират въз основа на растежа на дрождени клетки върху селективна среда или колориметрични анализи.

Изборът на метод за изследване на взаимодействията протеин-протеин зависи от специфичните протеини, които представляват интерес, наличието на реагенти и оборудване и желаното ниво на информация. Комбинации от тези техники могат също да се използват за получаване на цялостна представа за взаимодействията протеин-протеин.