Как да се установят NADH

Никотинамид аденин dinuceltoide ( NADH ) , съкратено " NAD " , е коензим намерени в живите клетки, които произвеждат химически реакции в протеини . Фармацевтичните компании изучават NADH , защото на своя процес на обмяната на веществата, и по синтетичен път го създават за редица цели. Тъй NADH е микроскопичен , с невъоръжено око не може да го забележи . Трябва научно изследване и комплект за анализ за установяване на неговото присъствие . Нещата ще трябва
сух лед
Micro - центрофуги
Епендорф тръби MarketBook.bg: Покажи повече инструкции
Reagent Разтварянето

1

Комплект буфера колоездене на брояч и да позволи на буфера да достигне стайна температура. Идеалната температура за буфера е 22 градуса по Целзий.

2

Разтворете NAD колоездене ензимен микс с точно 220 микролитра колоездене буфер. Замразявайте разтвора при температури под -70 градуса по Целзий.


3

Разтворете разработчика NADH с 1.2 мл ddH2O . Внимателно разбъркайте разтвора , докато се разтвори напълно. Не вихър .

4

Разтворете NADH стандартно с 200 микролитра на чист диметил сулфоксид .


Подготовка на проба

5

Измийте клетките с фосфат - буфериран физиологичен разтвор.

6

Pellet 2x10 ( 5 ) клетки за всяка отделна проба в епруветка за микро - центрофуга и работят при 2000 RPM в продължение на 5 минути. в
7

извличане на клетките с 400 микролитра от NAD /NADH екстракционен буфер чрез замразяване и размразяване на клетките в два цикъла - 20 минути на сух лед и 10 минути при стайна температура . Vortex добитите клетки за точно 10 секунди.

8

Spin клетъчните проби в микро - центрофуга при 14,000 RPM за точно 5 минути.

9

Прехвърлете NAD /NADH клетки в чиста епруветка.


протокол за изследване в
10

Разреждат се 10 микролитра на стандарта NADH с 990 микролитра NAD /NADH екстракционен буфер . Добави 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 микролитра от разредения разтвор в 96 - ямкова плака в два екземпляра за създаване на 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 и стандарт. Напълнете миналата кладенеца с 50 микролитра от буфер за екстракция на NAD /NADH .

11

Transfer 50 микролитра от добитите клетъчни проби в 96 - ямкова плака в дубликати на , както преди.

12

Подгответе клетъчните проби за откриване на NADH . Разграждат NAD от клетъчните проби с удар 200 микролитра на екстрахират клетъчни проби в епруветки на Епендорф . Нагрейте тръбите до 60 градуса по Целзий в продължение на точно 30 минути с контролирана температура на водна баня. Бързо охлаждане на пробите чрез поставяне на тръби върху лед . Spin пробите в микро - центрофуга за отстраняване на утайки . Transfer 50 микролитра на разложени проби в 96 - ямкова плака в дубликати на , както преди.

13

Смесете NAD колоездене буфер микс с 100 микролитра на NAD колоездене буфер микс и 2 микролитра NAD колоездене ензим. Добавете 100 микролитра на това ново решение във всяка ямка на стандарти NADH и проби .

14

Инкубирайте плаката при стайна температура в продължение на точно 5 минути. Този процес ще преобразува NAD да NADH .

15

Добавете 10 микролитра от NADH разработчик във всеки добре . Плаката се оставя да стои при стайна температура в продължение на минимум 1 час и максимум 4 часа.

16

Прочетете плоча и се изчислява на NADH .


<Бразилски>