Western Blot Инструкции

Western блот анализ е добре познат метод за идентифициране на специфични протеини , изолирани от тъкан . Различните протеини са разделени от първа разходи и тегло на SDS - полиакриламиден гел и се прехвърлят върху нитроцелулозна мембрана . След прехвърляне , маркирани антитела се свързват специфично с желания протеин и са заснети с помощта на рентгенов филм или визуализира чрез протеин - специфични оцветители . Крайният резултат показва тъмни ивици , показващи наличието на идентифицирания протеин . Тази статия се фокусира върху основната методология за извършване на Western блот анализ в лаборатория, се класира за комплекс протеин изследвания. Нещата ще трябва
SDS - полиакриламид гел ( SDS - PAGE) с разделените протеини
Nitrocellulose мембрана
дестилирана вода
Transfer буфер (30 г Tris, 144 гр Glycine и 200 мл метанол в 1 л вода)
филтърна хартия Whatman 3 mm
Laboratory гъба
Western блот трансфер камера
Laboratory захранване
Laboratory хладилник
Laboratory бъркалка
Tris буферен физиологичен разтвор ( TBS) ( 24.2 гр Tris Base, 80грама NaCl в 1 л вода )
Блокиране разтвор ( 5% обезмаслено мляко на прах в TBS)
решение Primary антитяло
Означени решение конюгат антитяло
алкална фосфатаза субстрат разтвор с нитро син тетразолиево петно ​​
фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS )
Gel - камера кутия MarketBook.bg: Покажи повече инструкции
Трансфер Протеини да Nitrocellulose Membrane

1

Подгответе нитроцелулоза мембрана. Мембраната трябва да се накисва в дестилирана вода в продължение на две минути, след това се поставя в буфера за прехвърляне и се оставя да кисне в продължение на пет минути.

2

Сглобете сандвич с трансфер , състояща се от гъба /филтърна хартия /SDS PAGE /нитроцелулоза мембрана /филтърна хартия /гъба. Сандвичът е съобразена така, че мембраната се намира по-близо до анода и гела по-близо до катода вътре камерата за трансфер.


3

Добави трансферен буфер в камерата , така че сандвичът е потопена . Поставете камерата вътре в лаборатория хладилника . Прехвърляне на протеин от гела на мембраната трябва да се извършва при 4 градуса по Целзий .

4

Настройка на захранването да прехвърлят протеини от гела върху мембраната . Посоката на трансфера е към анода , посочен от червения кабел . По-големи протеини се движат по- бързо в отговор на електрически ток и ще се движат последователно първо . Захранването контролира скоростта на трансфер . Настройте силата на 30 V и 40 mA за една нощ трансфер.

5

разглобявате захранването след края на прехвърлянето . Да не се правят контакт с буфера за прехвърляне или отстраняване на сандвича , докато захранването е приложен.

6

Свалете мембраната от сандвича и се оставя в продължение на два часа в блокиращ разтвор . Протеините в блокиращия разтвор ще абсорбират в мембраната , където не присъстват протеини . Това ще предотврати всяко антитяло от свързване към мембрана , където желания протеин не присъства .


Свързване на антитяло

7

Инкубирайте нитроцелулозна мембрана с първичния разтвор на антитяло , като се използва бъркалка . Мембраната трябва да бъде изцяло потопен в разтвора в продължение на поне един час. Приемливо е да се оставя да пренощува .

8

Измийте мембраната добре, за да се отстрани несвързаното антитяло. Четири отделни 10 - минутни промивки с TBS обикновено са достатъчни, за да се отстрани излишната антитяло.

9

Инкубирайте мембраната в етикетирани решение конюгат антитяло с помощта на смесителя . Мембраната трябва да се инкубират в продължение на поне един час. Маркиран конюгат антитяло се свързва с алкална фосфатаза . Това е ензим - антитяло микс , който ще разпознае и да се свързва с първото антитяло.


Detection на протеина в
10

Изплакнете мембраната за 10 минути в PBS четири пъти . Това отстраняване на остатъка на конюгата белязано антитяло .

11

Инкубирайте мембраната в алкален фосфатазен субстратен разтвор , докато се появят групата модели . Багрилото в разтвора на субстрата ще се свърже с антитяло - антиген - протеин в мембраната и образуват тъмно оцветена лента . Процесът може да бъде незабавна или да изискват до 30 минути, преди да се наблюдават лентите .

12

Увийте мембраната напълно в целофан и го поставете директно върху гел - камера за визуализиране на резултатите. The гел - камера е в състояние на фотографиране на резултатите , показани на Western блот мембрана.