Как да тествате за нуклеинови киселини

Тестване за нуклеинови киселини се извършва в медицинската диагностика, с цел откриване на патогенни микроорганизми, като вируси или бактерии . Тези тестове са много по- бързо и по този начин дават възможност на лекаря да започне лечение на пациент, който обикновено би трябвало да чака за потвърждение на инфекция с помощта на по- дълги и досадни анализи базирани на антитела . Процесът е известен също като тест амплификация на нуклеинова киселина , и включва метод, известен като " обратна транскриптаза усилване" чрез полимеразна верижна реакция . Тъй като това е високо специализирана научна процедура , задълбочени познания и опит в областта на молекулярната биология и техники е необходима теория. Нещата ще трябва
PCR епруветки
PCR колоездач
пипети и филтърни съвети
Ръкавици
Cells
Trizol или друга RNA екстракция реагент
PCR буфер
Taq полимераза <Бразилски> RT- PCR праймери при една концентрация мг /мл
RNase вода без
дНТФ
MgCl2
Случайни грундове на 1,8 мг /мл концентрация
система Superscript II обратна транскриптаза
<Бразилски> Покажи повече инструкции
преработка и подготовка на РНК в
1

жътва клетки с екстракционен реагент РНК , като Trizol . 1 мл , е достатъчно, за да се съберат клетки от един и на тъканна културална плака шест - добре . Клетките са старателно с пипета нагоре и надолу , за да ги хомогенизира и след това извършва процедурата по екстракция , както е описано във фиша Trizol . Накратко , екстрахира се с хлороформ , след това се центрофугира за отделяне на фазите на ДНК , РНК и протеин . Възстановяване само безцветен RNA фаза и се утаява , че с изопропанол . След инкубация , центрофуги , че и почистване на получените пелети с няколко измивания етанол. След това пелетата се разтваря в свободна от РНКаза вода .

2

за обратна транскрипция , денатуриране точно 5 микрограма РНК при 65 градуса по Целзий в 10 микролитра (UL ) обем на свободна от РНКаза вода , след това бързо поставете върху лед. За всяка реакция , се комбинират 10 ул. на РНК , 3 мкл 10Х PCR реакционен буфер , 2,5 мкл 10 милимоларен дНТФ , 6 л 25 милимоларен магнезиев хлорид , 1 мкл произволни праймери от 1.8 милиграма на милилитър концентрация , и 0,5 мкл система Superscript II ензим обратна транскриптаза . Долейте всяка реакция с 17 на ул. RNase без вода. Епруветките се култивират при стайна температура в продължение на десет минути и след това при 42 градуса по Целзий за един час, за да се получи сДНК , след денатуриране при 95 градуса по Целзий и бързо лед за да се спре реакцията.


3

за полимеразна верижна реакция , отново се създаде реакционната смес в 0,5 -милилитрови епруветки чрез комбиниране 6 мкл кДНК направен в обратна транскрипторна реакция , 1.5 мкл 10Х PCR реакционен буфер , 0,2 микролитра на Taq полимераза, 0.5 микролитра на обратен праймер и също на напред грунд , а след това в началото на всяка епруветка с 10.3 на ул. RNase без вода. За да работи реакциите , създадени термоблок ( т.е. машина, която извършва полимеразно верижни реакции ) за 30 цикъла , както следва : 95 градуса по Целзий за 0,5 минути за денатуриране , последвано от 60 градуса по Целзий в продължение на 45 секунди, за да се отгряват , и накрая 72 градуса Целзий в продължение на 1 минути, за да се разшири синтезира стенограмата .