Как да се измери NADH

NAD и NADH са двете пиридинови нуклеотиди , участващи в обмяната на веществата. NADH и NAD са коензими , открити в митохондриите , на суперсили на клетката. Както NAD и NADH са включени в клетъчни реакции като дишане и фотосинтеза , където се генерира енергия и водород . NAD и NADH гориво биохимични реакции, които изискват голям брой ензими за производство на ATP , основен източник на енергия в клетките . Нещата ще трябва
клетки или тъкани в процес на проучване на MarketBook.bg NADH кит
фосфат - буфериран физиологичен разтвор
Dry Ice
Отопление блок е. 96 и плоча
Центрофуга е. Означени тръби
Plate четец
Vortex
известна концентрация на NADH MarketBook.bg: Покажи повече инструкции
Състав

1

измийте клетки или тъкани в процес на проучване със студена фосфат - буфериран физиологичен разтвор , PBS . Екстракт клетки или разделят тъкан в екстракционен буфер чрез поставяне на сместа върху сух лед в продължение на 20 минути и след това при стайна температура в продължение на 10 минути. Повторете .

2

Vortex в продължение на 10 секунди. Центрофугиране в центрофуга в продължение на 5 минути, за да се утаят клетка или тъкан отломки . Премахнете супернатанта , течната фаза , и поставете течността в чиста епруветка.


3

Filter супернатанта чрез специализиран филтър за отстраняване на ензими, които ще разбивка NADH .

4

Премахнете 200 микро литра, място в чиста епруветка и се загрява при 60 градуса по Целзий в подгряващ блок в продължение на 30 минути, за да денатурират NAD . Охлажда се и се центрофугира и премахване течна фаза . Прехвърлят се 50 микро литра в чиния 96- добре; всяка проба трябва да бъде в два или три екземпляра . За да се определи общият NAD , NADt , не загрява .

5

Подгответе и добавете колоездене микс до 96 - и плоча . Разбърква се и се инкубира в продължение на 5 минути. Добавят се 10 микро литра разработчик и се оставя да се инкубират при стайна температура в продължение на до 4 часа. Добави гише решение . Прочети промяна на цвета на четящо устройство или флуориметър в зависимост от комплекта .


Standard Curve и изчисление

6

Приготвя се стандартна крива , като известна концентрация на NADH и разреждане в екстракционен буфер . Разрежда се в различни концентрации , като се гарантира крайния обем остава същата като проби за анализ . Плоча на същия 96-ямкова плака като тестови проби . Прочети оптична плътност.

7

Draw стандарт графика крива с концентрация по оста X и оптичната плътност на оста Y . Вземете средно на всяка проба и прочетете концентрацията от стандартната крива крива.

8

Изчислете съотношението на NAD /NADH чрез изваждане на общото NAD , NADt , от NADH и след това се дели на NADH . <Бразилски>