Как да провеждат анализ FRET

флуоресцентен резонансен пренос на енергия ( FRET ) е техника за анализ , използван за измерване на присъствието и количеството на свързване между две репортерни свързани протеини . Този тест обикновено се използва за анализ на потенциално свързващи протеини в различни видове клетки , и да се измери ефективността на свързване тип ензими. Апаратурата за откриване необходимо зависи до голяма степен от вида на репортерни молекули се използват , въпреки че много пъти обикновено 96 - ямкова плоча могат да бъдат използвани . Нещата ще трябва
Protein-of-interest/Reporter молекула конструкти за всеки протеин се тества
96 - и блок плоча
96 - и четящо устройство
реакционен буфер (обикновено Tris - или фосфат - буфериран физиологичен разтвор - базирани)
Conjugation ензим ( ако е необходимо)

Покажи повече инструкции
настройка и четене

1

Генериране или подготвят синтезирани структури на всеки протеин на интереси , с всеки от които е свързан с флуоресценция предаване молекула като зелен флуоресцентен протеин ( GFP) , родаминово или бор - дипирометенови ( BODIPY ) .

2

Определяне на абсорбцията и емисионните дължини на вълните на всеки флуоресцентен компонент и на общия анализ . ( Например , ако анализът измерва GFP -> родамин флуоресценция за пренос на енергия , дължина на вълната на входа е, че абсорбцията на абсорбция на GFP ( 488 нм ) , и дължина на вълната на емисиите е, че за родамин ( 595 нм ) )
.

3

Създаване подходящ реакционен буфер за експеримента , в зависимост от протеините на биохимични свойства на интерес . TRIS -базирана буфер често се използва , включително калциев хлорид и 0,05% Tween - 20 . Специфични концентрации и компоненти могат да бъдат определени чрез търсене на записи в дневника подробно подобни реакции и условия.

4

Смесете двата репортер - конюгирана протеините на интереси в различни концентрации в буфер реакция и аликвотна 50-200 ул. на ямка . Добави конюгиране ензим ( например , сортаза ) към всяка проба и , ако е необходимо . Ако се извършва анализа на крайна точка , позволете инкубация при стайна температура ( или оптимална температура на ензима ) за определен период от време , а след това прочетете на 96 - и четящо устройство . Ако се извършва анализа на кинетика , преминете направо към четенето ( виж по-долу ) .

5

Insert проба плоча на 96 - и четящо устройство . Създаване на нов експеримент страница и достъп до менюто за настройки . Input правилния абсорбцията ( възбуждане) и дължина на вълната на емисиите , а след това изберете подходящите ямки да бъдат прочетени .

Ако извършване на експеримент, кинетика , задаване на време - хода на експеримента и интервал на периода на отчитане (като веднъж 10 минути).

Започнете да четете проба.

Анализ на данни чрез функция графики Microsoft Excel (или друга програма, като например графики GraphPad ) .