Защо трябваше да миете кладенците след всяка стъпка?

Измиването на ямките на микроплаката след всяка стъпка в различни биохимични и молекулярно-биологични анализи като ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ), изолиране на ДНК/РНК, PCR и Western Blotting е съществена част от експерименталния протокол. Целта на етапите на промиване е да се отстранят остатъчните реагенти, реакционните компоненти или всякакви замърсители, които биха могли да попречат на следващите стъпки или да повлияят на точността и специфичността на анализа.

Ето няколко причини, поради които стъпките за измиване са необходими:

Отстраняване на несвързани вещества: Етапите на промиване след добавяне на реагенти или антитела помагат за отстраняването на всякакви несвързани вещества, като излишни антитела, неспецифични свързващи молекули или реакционни компоненти, които не са уловени или свързани с твърдата фаза. Това гарантира, че сигналът за откриване е специфичен и без фонови смущения.

Минимизиране на кръстосаното замърсяване: Етапите на измиване ефективно намаляват риска от кръстосано замърсяване между пробите. Това е особено важно, когато множество проби се обработват едновременно, тъй като предотвратява пренасянето на реакционни компоненти или замърсители от една ямка в друга. Измиването помага да се поддържа целостта и точността на резултатите от отделните проби.

Ефективно отстраняване на смущаващи вещества: Измиването е необходимо, за да се отстранят веществата, които могат да попречат на следващите стъпки. Например, при анализ ELISA, промиването помага за елиминирането на несвързани комплекси конюгат-антитяло, като по този начин намалява развитието на фоновия цвят и повишава специфичността на колориметричната реакция. При PCR промиването премахва нуклеотиди, праймери и полимерази от предишни цикли на амплификация, минимизирайки риска от пренасяне на замърсяване и осигурявайки точна амплификация в следващия цикъл.

Стандартизация и възпроизводимост: Като следват стандартизирани процедури за измиване, изследователите гарантират, че условията са последователни в експериментите и между различните лаборатории. Тази последователност е от решаващо значение за получаване на надеждни и възпроизводими резултати.

Процедурата на промиване може да включва използване на многоканална пипета или автоматизирана машина за измиване на плаките за дозиране и аспириране на промивния буфер. Промивният буфер обикновено е буфериран физиологичен разтвор, който наподобява състава на оригиналния буфер, използван в анализа, но не съдържа никакви реакционни компоненти.

Адекватното измиване без прекомерно пране е от решаващо значение. Прекомерното промиване може да доведе до загуба на основни компоненти, свързани с твърдата фаза, и да повлияе на чувствителността на анализа. Следователно протоколите за измиване са внимателно проектирани, за да се постигне оптимално отстраняване на нежелани вещества, като същевременно се запази целостта на имобилизираните молекули или аналитите, които представляват интерес.