Как да направим антитела разреждания за IHC

имунохистохимия ( IHC ) е специалист техника, използвана от учените, за да се визуализира клетки в тъкани, които са били поставени върху предметно стъкло и се оцветяват с подходящо антитяло, което разпознава протеин, който е уникален за клетката или тъканта под разследване. Антитяло разреждания ( титруване ) , трябва да се извърши с помощта на експерименталните условия , описани в собствен протокол на потребителя , а не тази на производителя на антитялото , тъй като двете не могат да бъдат еднакви . Нещата ще трябва
Cells да се оцвети
антитела
буфер за разреждане ( " разредител " )
пипети и съвети
Microfuge тръба
алуминиево фолио
Лабораторни маркери и тръбни етикети
Ice
слайд кутия защитено от светлина в
Покажи повече инструкции
е. 1

Проверка и подготовка на антитялото. Уверете се, че антитялото е повдигнат в правилния хост , и реагира с точната версия на протеин ( известен като изоформа , или сплайс- вариант ), който се тества . С помощта на пипета внимателно се взима на 10 микролитър част от този лейбъл и като " личен състав " .

Ако само много малки количества от антитела са на разположение , пропуснете тази стъпка.

Поддържане на личен състав на антитяло е рутинна практика във всички лаборатории , тъй като предотвратява кръстосано замърсяване от оригиналния състав. Поставят този в защитено от светлина микрофужен тръба , или един нормален микрофужен тръба, която е увита в алуминиево фолио, за да се предпази от пряка светлина .

Запазете тази тръба върху лед , за предпочитане в Esky с капак херметична , отново, за да се намали светлина, която може да унищожи антитялото . Обръщайте особено внимание на концентрацията на оригиналния състав (например 100 единици на милилитър , 1 милиграм на микролитър и т. н. ) на тръбата , включително името на антитялото и какво , ако има такива, буфер тя се разрежда в (например серум, физиологичен разтвор , или вода и т.н. ) .

2

Подгответе буфер за разреждане , известен също като разредител на антитяло . Проверете, за да се уверете, че това е съвместимо с антитялото и процедурата за имунохистохимия се използва , например, тя не трябва да прикрива флуоресценция или забраняването на който и последващото етикетиране вторично антитяло. Направи стандарт имунохистохимия разреждане ( също блокиращ буфер ) чрез смесване 1X фосфат буфериран физиологичен разтвор с 1% Triton - Х-100 , 10 % фетален телешки серум и 0.2% натриев азид .


3

титрува антитяло . С дадената концентрация на антитяло в личен състав ( изразен като концентрация единици като микрограма на милилитър ) , определяне на количеството на антитялото , необходима за получаване на 10 микрограма на антитяло .

Настройте серия на разреждане чрез поставяне обем равняваща се на 2 микрограма на антитела (напр. X микролитра ), в 100 микролитра на разредител и се разбърква старателно чрез поставяне нагоре и надолу. От този изходен разтвор , вземат същите X микролитра и добави, че на следващ 100 микролитра на разредител. Повторете това, докато 10.8 разреждания ( или серия ) се състои .

Следователно Последният тръбата ще има най-ниската концентрация и да бъде на " насищане " концентрация, която ще доведе до най-високото ниво на сигнала по време на експеримента . Въпреки това , идеалният концентрацията ще бъде малко по-концентриран от това , така че не е твърде много се произвежда сигнал , който може да доведе до грешки фон .

Етикет правилно тръби с нови разредени концентрации.