Как се извършва на ELISA анализ

Един ELISA , или имуноабсорбентен анализ ензим - свързан , е биохимична лаборатория техника направено за откриване на антиген ( като протеин ) или антитяло в експерименталната проба . Анализът се възползва от антитяло - антиген свързване и може да се използва за анализ друга клетка и молекулни механизми на свързване , както и . В анализ на протеин на базата на ELISA , на " улови " антитяло или протеин се определят с ястие анализ и се оставя да се придържат към ястието , след което " сондата " агент (като нечии интерес протеин ) е предвидена и се инкубират с улавяне агент. След няколко измивания , за " откриване " антитяло се добавя , за да се визуализира на присъствието или отсъствието на антитяло - антиген или протеин - свързващ протеин . Нещата ще трябва
Състав ястие ( например , 96 - и блок)
Уловете антитела ( разредени до 5 мкг /мл в 50 мМ NaHCO2 , рН 9.6)
Probe антитела /протеин ( разреждат до различни концентрации)
антитяло за откриване ( например , пероксидаза от хрян -свързан антитяло )
PT буфер (1х PBS , 0.05% Tween - 20 )
Блокиращ буфер (1х PBS с 5 мг /мл BSA , или 5% обезмаслено мляко в 1х PBS )
реагент Detection (т.е. смес TMB реагент )
Механична лаборатория шейкър
студена стая или хладилник
пипета и съвети на MarketBook.bg Покажи повече инструкции

1

Разрежда улавящо антитяло до 5 мкг /мл в 50 мМ NaHCO2 ( рН 9.6 ) . Добавят се 50 мкл към всяка ямка на блюдото на пробата за изпитване . Покрийте с пластмаса или алуминий и се инкубира една нощ при 4 ° С на клатачка .

2

зареже улавящо антитяло и се промива два пъти с 200 мкл PT буфер . Добавете 200 мкл от блокиращ буфер на ямка ( PB или 5% обезмаслено мляко) . Инкубирайте навсякъде от два часа, за една нощ , докато се разклащат при 4 градуса C.


3

зареже блокиращ буфер и се измива 4 пъти с 200 мкл PT буфер. Добавяне на " сонда " протеинови проби при различни концентрации в PB или 5% обезмаслено мляко , добавяйки 100 мкл за кладенче . Инкубира се един часа разклащане при 4 градуса C. зареже сонда решения и да се измие шест пъти с 200 мкл PT буфер.

4

Добави откриване на антитела ( HRP - спрегнато антитяло ), разреден 1:4000 в PB буфер или 5% обезмаслено мляко ( или една , съдържаща 0,05% Tween -20) , добавяне на 50 мкл на проба добре . Инкубира се за 30 минути до един час разклащане при 4 ° С. е.
5

зареже решение за откриване на антитела и се промива 6 пъти с 200 мкл PT буфер на ямка, последвано от промиване два пъти с 200 мкл 1x PBS ( фосфат - буфериран физиологичен разтвор ) . Dump от PBS и се добавят 100 мкл на реагент за откриване на добре (за HRP , използвайте прясно смесена TMB реагент чрез смесване TMB субстрат и пероксид при 1:1 ) . Инкубира се в продължение на 15 минути при стайна температура , като се разклаща от време на време .
<Стр.> при използване на ТМВ и HRP : Накрая , се добавят по 100 мкл от 1М Н3РО4 ( фосфорна киселина ) на ямка , за да се потуши реакцията на ТВМ

прочетен пластина посредством анализ проба четец , като 96 - ямкова плака . . (За HRP и TMB , използвайте шаблона " ELISA End -Point Анализ" на разположение на повечето читатели . )