Как да отстранявате Three Фрагмент Ligation

Ligation е метод, използван в изследванията на биологичното за присъединяване към отделни нишки на ДНК . Процесът е опростено използване на търговски китове лигиране . Процедура за лигиране се последва от трансформация , процес, вкарване на ДНК се присъедини в бактериален вектор получател , за клониране и усилване на ДНК. Поради сложността на метода , резултатите често не съответстват с желания продукт и изискват отстраняване . Това е по- преобладаващ в опит да се присъедини към множество фрагменти , като в тройно лигиране . Нещата ще трябва
Ligation комплект
Ligation протокол
Agarose гел
50 X TBA буфер ( 242грама Tris база, 57,1 мл ледена оцетна киселина , 100 мл 0,5 M EDTA разрежда до 1 литър с вода ) е. дейонизирана вода
ДНК кит за пречистване на MarketBook.bg Покажи повече инструкции
Отстраняване Transformation

1

Формулирайте списък от стъпки , участващи в лигиране и трансформация. Отстраняване на всяка научна протокол обикновено започва с последната стъпка , работещи назад.

2

Сравни пречистена ДНК-продукт от пробата с контролната ДНК , снабдена с комплекта. След като ДНК е трансформирана и се клонира в бактерии , може да се изолира , пречиства и се проверява чрез агарозна гел електрофореза . Резултатите за електрофореза ще посочват дали трансформацията е била успешна.


3

Определя развитието на бактерии по време на клонирането. Повечето бактериални вектори са конструирани така, че само тези, с ДНК вложка - ще растат върху среда, съдържаща ампицилин, или друг антибиотик . Лош растеж може да се установи, че пробата от ДНК не бе успешно поставена във вектора .

4

Уверете се, че лигира ДНК проба се пречиства , преди преобразуването . Буферни соли и лигиране ензими могат да инхибират превръщането на вмъкнатата ДНК . Важно е също така да се установи , че ензимът лигиране се инактивира чрез загряване , след завършване на процедурата на лигиране . Active лигаза потенциално биха могли да пречат на трансформация.

5

Проверете датата, на бактериален състав, използван за преобразуване . Старите бактериалните клетки губят ефективност с течение на времето . В крайна сметка бактериалните клетки са в състояние на трансформация и качество клониране . След като процесът на трансформация е бил диагностициран , вие може да започне анализ на процедурата за лигиране .


Отстраняване Ligation

6

Потвърдете чистотата на вашата ДНК проба , преди лигиране . Сол замърсители в пробата от ДНК биха могли да доведат до лошо лигиране . ДНК пробата трябва да бъде пречистена и без соли и ензими , преди да се използва в лигиране .

7

потвърди дали краищата на веригите на ДНК се лигират са тъпи или лепливи . Лигиране се използва за свързване на отделни нишки с тъпи краища или лепкави краища , след храносмилането с определени ограничителни ензими . T4 ДНК лигаза е ензим на избор за тъп край ДНК - но тя също така ще работи за ДНК с лепкави краища. Други ДНК лигази могат да работят само за ДНК , след смилане ограничение за създаване на лепливи краища . Важно е да се използва правилното лигазата за изпитваното ДНК.

8

Проверете концентрацията на ДНК проби преди лигиране . Използването на ДНК с висока концентрация често причинява ДНК да стане линейна. Инструкциите за комплект ще предоставят информация за точния размер на ДНК, за да се използва в реакция на лигиране .

9

Сменете лигазен ензим с нова партида. Ензимите са особено чувствителни при стайна температура и продължава замразяване - размразяване . Лигазата може да се повреди вследствие на редица приложения , просто чрез замразяване и размразяване твърде много пъти . Някои комплекти препоръчват лигаза бъде разпределена в по-малки порции по време на първоначална употреба , за да се намали броят на пъти е повторно замразена .

10

Проверете комплекта за лигиране . Често проблемът с лигиране е с помощта на комплект, който е изтекъл или са замърсени с други ДНК и соли.